摘要：以小麦秸秆为底物，对不同NaOH预处理条件下小麦秸秆的纤维素酶水解效率进行了研究，考察因子包括NaOH质量分数、小麦秸秆固体含量、预处理时间，同时利用扫描电子显微镜（SEM）分析了酶水解过程中小麦秸秆的结构变化。结果表明，在NaOH质量分数为1.00%、小麦秸秆固体含量为0.050 g/mL、预处理时间为60 min时，小麦秸秆的糖化效率最高，总还原糖的产率达到86.61%，较未处理时产率提升74.60个百分点。利用最佳预处理条件下的小麦秸秆进行同步糖化发酵，其乙醇产率达到71.70%，较未处理时产率提升49.30个百分点。 
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　　关键词：小麦秸秆；糖化发酵；NaOH预处理 
　　中图分类号：TQ353 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）18-4355-04 
　　第二代生物质乙醇是利用不同的原料如木材、农业或者森林废弃物来生产，纤维素乙醇作为一种重要的可再生能源，具有能够支撑全球能源消耗20%～100%的潜力。在纤维素乙醇的生产过程中非常重要的一步就是将半纤维素和纤维素水解为单糖，目前最具发展前景的水解方法为纤维素酶水解。为了使纤维素酶能够与纤维素有效接触，需要在水解之前对木质纤维素材料进行预处理，解除木质素、半纤维素等对纤维素的保护作用，同时破坏纤维素的结晶结构，增加其比表面积[1]，从而提高纤维素的水解糖化效率。 
　　NaOH溶液的润涨处理是发现最早、应用最广的预处理手段之一，其处理温度和压力都低于其他预处理手段[2]。NaOH预处理打开了交联木质素和木聚糖的酯键，能够部分溶解原料中的木质素、半纤维素，降低纤维素的结晶度，同时增大了木质素材料的比表面积，能够得到较高的酶解糖化率，是一种较为有效的预处理方法[3]。 
　　本试验使用NaOH溶液对小麦秸秆进行预处理，分别研究了NaOH质量分数、小麦秸秆固体含量、预处理时间等因素对小麦秸秆纤维素酶水解过程的影响，得到了最佳的NaOH预处理条件，之后对经最佳条件预处理后的小麦秸秆进行了同步糖化发酵试验，并在电子显微镜下观察了预处理前后的秸秆结构变化，进一步明确了NaOH预处理的效果。 
　　1 材料与方法 
　　1.1 材料 
　　1.1.1 原料 小麦秸秆取自太湖农村，机器收割，不含秸秆根部和麦穗。 
　　1.1.2 酶制剂 纤维素酶购自Sigma公司，为淡黄色液体纤维素酶。 
　　1.1.3 酵母菌 试验所用酵母为酿酒酵母BY4742， 于4 ℃下保存。 
　　1.2 方法 
　　1.2.1 小麦秸秆预处理 小麦秸秆粉碎后过80目筛，烘箱中55 ℃干燥，设置不同质量分数的NaOH、小麦秸秆固体含量及预处理时间，在121 ℃、0.2 MPa的条件下在高压灭菌锅中进行预处理。预处理结束后冷却至室温，加入适量的稀盐酸调节pH至中性，之后使用高速离心机进行离心并清洗3～5次。预处理后的小麦秸秆于105 ℃烘干，保存于干燥皿中备用。 
　　1.2.2 纤维素酶水解 分别取未经预处理以及经NaOH预处理的秸秆各4.0 g，定容至100 mL，根据本课题组前期研究结果[4]，选取纤维素酶投加量为30 FPU/g秸秆，温度40 ℃，柠檬酸盐调节pH为4.8，共水解120 h，每隔24 h取样1次，离心后取上清液进行HPLC分析。 
　　1.2.3 同步糖化发酵 根据本课题组关于同步糖化发酵条件的研究，分别取未经预处理以及最优条件下NaOH预处理后的秸秆各1.6 g，确定固体含量为0.16 g/mL，纤维素酶投加量为35 FPU/g秸秆，酵母菌浓度8 g/L，柠檬酸盐调节pH为4.0，温度设置为38 ℃，同步糖化发酵120 h，每隔24 h取样分析。 
　　1.3 分析方法 
　　1.3.1 小麦秸秆成分分析 小麦秸秆纤维素、半纤维素和木质素含量的测定采用NREL实验室提供的方法[5]。 
　　1.3.2 还原糖及乙醇含量测定 样品中纤维二糖、葡萄糖、木糖、乙醇浓度采用Shimadzu高效液相色谱分析仪检测，检测器为示差折光检测器，色谱柱为Aminex HPX-87P Column。检测条件：柱温65 ℃，检测器温度60 ℃，流动相为超纯水，流速0.8 mL/min，进样量20 μL。 
　　1.3.3 小麦秸秆结构分析 采用电镜扫描观察。样品在室温风干之后平铺于导电胶上，进行离子溅射金处理45 s，用JSM-7401F场发射扫描电子显微镜观察。 
　　1.3.4 计算公式 纤维素水解产生葡萄糖的化学方程式如方程式（1）所示，理论上，100 g纤维素水解可产生111.1 g葡萄糖。葡萄糖发酵产乙醇的化学方程式如方程式（2）所示，理论上，100 g葡萄糖发酵可产生51.1 g乙醇和48.9 g CO2。由此可知，100 g纤维素理论上可产生56.8 g乙醇。 
　　2 结果与分析 
　　2.1 不同NaOH预处理条件对小麦秸秆酶解效果的影响 
　　2.1.1 NaOH对小麦秸秆酶解效果的影响 本试验首先考察了不同质量分数的NaOH预处理条件下，纤维素酶水解小麦秸秆的效果。分别以0.25%、0.50%、1.00%、2.00%和4.00%的NaOH溶液预处理已粉碎干燥的小麦秸秆，之后进行120 h的水解试验，并每隔24 h取样进行还原糖含量分析。经不同NaOH溶液预处理后小麦秸秆水解产物中还原糖情况如图1所示。预处理过的小麦秸秆经过酶解后，主要产生了纤维二糖、葡萄糖、木糖3种还原糖，由图1可以看出，随预处理NaOH质量分数的增加，酶解液的还原糖含量逐渐升高，其产量均在NaOH质量分数为1.00%时达到最高，其中葡萄糖含量在酶水解48 h时达到最高，为14.13 g/L。之后NaOH质量分数继续增大时，还原糖产量开始下降，可能因为在预处理过程中NaOH溶解半纤维素和木质素的同时也水解了部分纤维素，还原糖进入了液相，在进行固液分离时损失[6-8]。 　　2.1.2 固体含量对小麦秸秆酶解效果的影响 本试验设置预处理时的小麦秸秆固体含量分别为0.025、0.050、0.100、0.150和0.200 g/mL，采用在“2.1.1”方法中确定的NaOH预处理最佳质量分数1.00%对小麦秸秆进行预处理，之后进行120 h的酶解试验，每24 h取样测定其还原糖含量。不同固体含量下NaOH预处理产物中还原糖含量如图2所示。由图2可见，预处理过程中在小麦秸秆固体含量提高到0.050 g/mL时，酶解液中的3种还原糖含量均达到最高。其中葡萄糖在纤维素酶水解48 h时其浓度达到最大值14.13 g/L。之后固体含量继续增大时，其还原糖产量下降。分析其原因可能是预处理过程中固体含量对预处理强度产生影响，固体含量过高时，因NaOH溶液的量相对减少，难以与秸秆充分接触，从而影响了预处理效果[9，10]。 
　　2.1.3 预处理时间对小麦秸秆酶解效果的影响 本试验设置预处理时间分别为15、30、50、60和90 min，采用“2.1.1”方法得到的预处理最佳NaOH质量分数1.00%和“2.1.2”方法得到的最佳固体含量0.050 g/mL对小麦秸秆进行预处理，之后进行120 h酶解，每隔24 h取样测定其还原糖产量。不同预处理时间下3种还原糖的产量如图3所示。 
　　由图3可见，随着预处理时间的增加，小麦秸秆酶解液3种还原糖含量在60 min时达到最大。其中葡萄糖浓度在酶水解24 h后达到最大值15.30 g/L。预处理50 min以上时，NaOH溶液对木质素和半纤维素的溶解基本完成，纤维素充分暴露出来，预处理时间增加到60、90 min时，酶解产生还原糖的浓度变化不大，考虑到增加预处理时间会显著增加能耗，故将60 min确定为最佳预处理时间。 
　　2.2 NaOH预处理对小麦秸秆酶解效果的影响 
　　通过上述试验可以得到NaOH预处理小麦秸秆的最佳条件为NaOH质量分数1.00%，小麦秸秆固体含量0.050 g/mL，预处理时间60 min。将经过预处理的小麦秸秆残渣酶解120 h，其反应进程见图4。 
　　由图4可知，在最佳预处理条件下，酶解24 h时，酶解液总还原糖产量达到最大，为34.65 g/L，其产率为86.61%。而未经预处理的小麦秸秆在酶解刚开始时总还原糖产量便开始下降，最高仅为4.80 g/L，其产率仅为12.01%。最佳预处理条件下的总还原糖产率也明显高于常规的稀碱预处理的总还原糖产率[3]。这是因为NaOH预处理对半纤维素和木质素均有较好的去除效果，解除了木质素和半纤维素对纤维素的保护作用，同时破坏纤维素大分子之间的结晶结构，增大了小麦秸秆的比表面积，改善了底物与纤维素酶的接触效果，同时也有效减少了木质素对纤维素酶的特异性吸附，使纤维素酶可以充分作用于底物，有效提高了小麦秸秆的酶解效果[11，12]。 
　　2.3 小麦秸秆成分分析 
　　使用NREL实验室的方法分别测定未经NaOH预处理的小麦秸秆与经过最优条件预处理过的小麦秸秆成分，结果如表1所示。由表1可见，小麦秸秆在经过了最优条件预处理后，木质素的含量由25.73%降低至11.75%，同时纤维素的含量由39.31%升高至58.84%。表明NaOH能够提高纤维素在底物中所占比例，同时降低木质素等所占比例[13]，有利于后续酶解进程。 
　　2.4 同步糖化发酵结果 
　　未经NaOH预处理的小麦秸秆与经过最佳条件预处理的小麦秸秆经同步糖化发酵后上清液成分如表2所示。 
　　由表2可见，未经NaOH预处理的小麦秸秆由于结晶以及木质结构的保护，酶解过程受到抑制，进而影响了酵母菌对还原糖的发酵。而经过最佳NaOH预处理条件处理后，乙醇的产量大幅上升，由处理前的7.98 g/L上升到38.32 g/L，乙醇产率由22.40%上升至71.70%，无法被酵母菌利用的木糖含量也由处理前的0.80 g/L上升到了12.94 g/L。 
　　由此可见，NaOH预处理不仅能够有效去除木质素，而且基本不影响纤维素[14]，纤维素可以进一步水解并发酵产生乙醇，NaOH预处理是一种高效的木质纤维素产乙醇的预处理方法。 
　　2.5 NaOH预处理前后小麦秸秆结构分析 
　　小麦秸秆粉末在NaOH溶液质量分数为1.00%、固体含量0.050 g/mL、121 ℃、0.2 MPa的条件下预处理60 min，恢复至室温干燥后备用。同时准备一份未经预处理的小麦秸秆粉末，干燥后备用。样品平铺在导电胶上，喷金45 s后用扫描电镜观察，其SEM结果如图5所示。 
　　由图5可见，未经NaOH预处理的小麦秸秆表面光滑，纤维排列比较整齐，没有明显的破损和孔隙，结构致密。经过NaOH预处理后的小麦秸秆的半纤维素、纤维素和木质素的部分结构遭到破坏、分离，纤维和纤维束出现卷曲和折叠，变得柔软疏松，排列凌乱；秸秆表面由预处理前的致密变得疏松，有序排列变得杂乱无章；原来光滑的表面上出现了片状的物质，这可能是溶出的半纤维素和木质素[15]。经过预处理的小麦秸秆的比表面积大大增加，这更有利于纤维素酶的吸附，有利于水解，从而提高了酶水解液中还原糖的得率。 
　　3 结论 
　　1）NaOH预处理小麦秸秆的最佳条件为：NaOH质量分数1.00%，小麦秸秆固体含量0.050 g/mL，预处理时间60 min。 
　　2）经过NaOH预处理的小麦秸秆水解液还原糖得率可提升74.60个百分点。 
　　3）通过SEM观察发现，经过NaOH预处理后，秸秆表面变得粗糙，有利于纤维素酶的吸附及进一步水解。 
　　4）经过最佳条件NaOH预处理的小麦秸秆进行同步糖化发酵其乙醇产率提高了49.30个百分点。 
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